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    2022-12-14 高考期间作业帮 高三作业帮

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    图书名称:《动物疫病基因工程疫苗研究与进展》【作者】邱昌庆,才学鹏主编【页数】455【出版社】北京:中国农业出版社,2005.12【ISBN号】7-109-10524-5【分类】基因-遗传工程-应用-兽疫-疫苗-文集【参考文献】邱昌庆,才学鹏主编.动物疫病基因工程疫苗研究与进展.北京:中国农业出版社,2005.12.图书目录:《动物疫病基因工程疫苗研究与进展》内容提要:“十五”国家高技术研究发展计划(863计划)课题研究论文汇编:本书分上、下两篇。上篇为文献综述,共17篇,分别描述了国内外相关动物疫病防治技术研究的最新进展;下篇为研究报告,共40篇,详细记录了不同分子疫苗或诊断技术的研究过程和情况,附有大量试验图片。《动物疫病基因工程疫苗研究与进展》内容试读料架西安话上篇文献综述骨事出高外院一话雷酒中(目离率原海禄本干山合中头人点来的形歌有伯实结白州全卖发高居面世落话的净春能幸剂口1出好,布南数女液口元微然55出从不代孩苗致链版数动卧,夜近的便新家行出出管家用司的的的的白败,秋因胰时己际购出许不边街贸张税日面安由,下上千生气是花费品天箱的平用手如#初出名甲均外安潮口海明大海外装家角的的夹装口出储水首器京时中批期发大亚真雪数亚条《A)知理解通事年年保香天阳量常由赛大安2国头本容味水回邮曜空兰不河味,有香号福的西8(V组0士好转5A通辛的超台2者的4藤代衣中道单水每诗的。答白球孕V行西向,名州氣动心可名古太过流汤路出天字米还省州联资品法白科的中流尘师0的头璃弹数中的秋员序白而休出供表全的语要子荧的式课安通场中小健余性政勿只客在眼官试特平政黄的以身生年言说:国材为出下烟百奇计达联利来印特用味票出的浙子”2位日室定海子;时场场记水施女2动物疫病基因工程疫苗研究与进展口蹄疫分子疫苗研究展望卢曾军曹轶梅刘在新谢庆阁(中国农业科学院兰州兽医研究所国家口蹄疫参考实验室,甘肃兰州730046)摘要:传统疫苗(主要指灭活疫苗)在口蹄疫的防制中起到了巨大的作用,然而由于大量的增殖自然病毒,使得在疫苗的生产和使用过程中存在许多风险。目前,尽管传统灭活疫苗在口蹄疫防制中仍然具有不可替代的作用,但人们在新型分子疫苗的研究方面也同样给予了足够的重视,试图通过基因工程技术来降低口蹄疫疫苗生产和应用中存在的诸多风险。分子疫苗的研究尽管在合成肽疫苗和重组载体疫苗方面取得了突破性的进展,但亦然是任重道远。关键词:口蹄疫,分子疫苗口蹄疫(FM⑩)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄动物的一种急性高度传染性疫病,被国际兽疫局(OIE)列为A类动物传染病之首。由于本病传播迅速,感染率高且难以控制和消灭,暴发此病后,会对社会经济和政治造成严重影响,因此各国政府对此病的防制都极为重视,高效、安全、广谱的口蹄疫疫苗一直是世界各国研究的热点。从20世纪初就已经开始了口蹄疫疫苗的研究,l927年Berli进行了口蹄疫病毒弱毒疫苗的研究,随后许多研究者也进行病毒致弱的研究,但由于口蹄疫弱毒疫苗毒力不稳定,而且弱毒疫苗的应用不利于进行感染动物与免疫动物的鉴别诊断,因此,现在已经停止使用弱毒疫苗。实际能够达到应用水平的口蹄疫灭活疫苗最早产生于1937年,由Waldma等首先研制出口蹄疫组织灭活疫苗。随后的组织培养技术的发展,使口蹄疫疫苗真正可以大规模地生产和应用12)。口蹄疫常规灭活疫苗,常用的灭活剂有甲醛、乙酰乙烯亚胺(AEI)、二乙烯亚胺(BE)、阝-丙内酯等。佐剂有氢氧化铝胶、皂素、弗氏不完全佐剂、油包水乳剂等。在疫苗中添加分枝菌细胞壁的可溶性部分、合成硫辛酰胺、Avridie等作佐剂生产FMDV油佐剂灭活苗,可以降低抗原的用量,同时增强FMDV的细胞免疫应答)。随着病毒浓缩和纯化技术的研究和在生产中的应用,口蹄疫高效疫苗和多价疫苗成为未来灭活疫苗研制的发展方向。灭活疫苗以细胞培养的全病毒经提纯灭活后作抗原,因而具有良好的免疫原性,免疫动物后产生良好的体液免疫,并伴随有细胞免疫应答,具有良好的保护作用。缺点是,灭活疫苗的热稳定性差,要求低温保存,免疫持续期短,抗病毒谱有限,有造成持基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)课题(编号:2003AA241110)上篇文献综述3续感染的危险性[幻,由于疫苗中带有痕量的非结构蛋白成分,因而不利于区分注苗动物和自然感染动物,同时存在病毒灭活不彻底而散毒的可能性)。尽管传统疫苗在全世界口蹄疫的防制中取得了很大的成功,但从20世纪70年代开始,口蹄疫病毒新型疫苗的研究就已经开始,到目前为止,在口蹄疫研究中仍然占有很重要的地位。新型疫苗的研究热情未减,这主要是因为,新型疫苗与传统疫苗相比,在制造过程中不动用原始活毒,减少了病毒扩散的机会,因而更安全;新型疫苗研究中考虑到了口蹄疫鉴别诊断的需要,有利于建立鉴别免疫动物与自然感染动物的方法。口蹄疫新型疫苗主要包括以下几种:最先研究的是蛋白质、蛋白片段和病毒亚单位疫苗,其抗原主要来自细菌、杆状病毒、甚至植物表达系统中表达的病毒抗原;随后又发展了合成肽疫苗、复制性和非复制性载体疫苗、基因工程致弱的弱毒疫苗和DNA疫苗,但至今还没有一种基因工程疫苗问世。1基因缺失标记疫苗在口蹄疫病毒感染性cDNA克隆的基础上,可以通过缺失一些重要的毒力基因,研制基因工程致弱毒,通过适当的分子标记,就有利于建立鉴别疫苗免疫动物与自然感染动物的诊断方法。用这种方法生产的弱毒疫苗,可以同时刺激机体全面地抗病毒免疫反应,理论上讲,免疫效果应当优于灭活疫苗。也可以用基因工程致弱的标记弱毒来生产灭活疫苗,以增加生产过程中的安全性,又可以提供鉴别诊断的方法。研究表明,口蹄疫病毒的oy(C)片段可能与病毒的毒力有关,但含有2个核苷酸的oy(C)的基因工程毒对小鼠同样具有毒力,在脑心肌炎病毒的研究表明,短的oly(C)仅对毒力有轻微的减弱。口蹄疫病毒的前导蛋白L具有类似于木瓜蛋白酶的活性,可以催化自身同聚蛋白的裂解分离,在细胞内可以裂解真核翻译起始因子elIF-4G,从而阻断了宿主细胞从mRNA5'端开始的蛋白翻译合成(ca-deedet),而病毒RNA的翻译(ca-ideedet).却不受影响。缺失L基因的A12型基因工程毒可以在BHK-21细胞内增殖,但比野毒株要慢,对乳鼠的致病力也减弱,通过气源性感染牛发现毒力的确减弱,致弱毒在肺组织和表皮组织没有大面积的扩散,5个PFU的牛体传代野毒即可引起牛发病,而725000P℉U的致弱毒不能使攻击牛产生任何的临床症状,10?~108P℉U的致弱毒通过肌肉注射对牛无致病性。在猪体试验也得到了类似的结果。用缺失L蛋白的基因工程致弱毒制造灭活疫苗对牛和猪可产生部分的保护作用)。突出于衣壳表面的G一H环是口蹄疫病毒粒子表面结构的一个显著特征,尽管这个环具有高度可变的特性,但位于最顶端的精氨酸-甘氨酸~天冬氨酸(RGD)三肽序列却具有高度的保守性。RGD序列是病毒细胞受体结合的重要位点,也是中和抗体结合的重要位点。存在RGD序列变异突变株病毒,但这种突变不稳定,很容易发生回复突变。通过定点突变的方法直接缺失RGD序列而产生的感染性cDNA,通过特殊的电穿孔方法转染BHK~21细胞,可以产生大量的缺失RGD序列的病毒粒子,通过与单克隆抗体结合试验证明,这种缺失对病毒的抗原结构破坏很小。缺失病毒在BHK~21细胞和小4动物疫病基因工程疫苗研究与进展鼠体内试验证明其毒力和感染性都不会出现反复,与其原始野毒相比,毒力下降为原来的0.0001%。将这种缺失毒接种猪蹄部的敏感部位,野毒攻击猪可以产生明显的临床症状,而缺失毒攻击猪没有出现任何临床症状,也没有病毒的增殖,2C、3AB、3C血清抗体检测为阴性。用这种RGD缺失毒来免疫牛甚至产生了比灭活疫苗更好的免疫保护作用(McKea等,1995)。I.eiert等(1997)研究证实,RGD序列在病毒感染过程中的作用,RGD内部发生突变的感染性cDNA不能通过一般的方法转染BHK-21细胞产生病毒粒子,但其两侧的序列发生突变则可以转染BHK-21产生明显的细胞病变,说明RGD两侧序列具高度的灵活性和可变性,这也是FMDV可识别多种细胞受体、宿主范围宽广的-一个原因。FMDV可以利用不同的细胞受体而进人细胞,有些是RGD序列依赖性的,有些则不是,如果能够找到RGD缺失病毒的敏感细胞系,则可以通过一般的方法大量地增殖病毒,用于免疫研究。非结构蛋白3A的变异与FMDV对牛致病力减弱有关,但1997年中国台湾猪流行毒3A部分在相同位置也有缺失。C型克隆毒C-S8c1在豚鼠体内的适应性传代,发现在结构蛋白(VP1)与非结构蛋白(2C和3A)编码区均有一个氨基酸的改变,而3A区Q44→R个氨基酸的替换就足以对豚鼠产生致病力,这些变化可能与宿主嗜性的改变有关8]。FMDV在鸡胚传代过程中也发现有3A的缺失。对小RNA病毒科病毒3A蛋白功能的研究表明,3A蛋白可能与病毒RNA的合成有关,在3A蛋白的53~81位氨基酸形成一个疏水性域,在细胞内可能是3B蛋白的膜锚,3AB具有RNA结合活性,与前体蛋白3CD一起形成个核蛋白复合体,参与病毒RNA的合成。在小RNA病毒科中,不同属的病毒其3A的长度不同,3B的拷贝数也不同,这些现象有什么生物学意义?通过反向遗传学的方法,构建含有不同长度3A基因和不同拷贝数3B基因的感染性克隆,研究不同基因工程毒的生物学特点,有可能揭示3A和3B的精确生物学意义,同时也为研究基因工程弱毒疫苗提供可靠的数据。至今国内外还没有口蹄疫分子标记疫苗的研究报道。研究标记疫苗的目的在于鉴别疫苗免疫动物与自然感染动物,消除隐性感染,避免口蹄疫防制中大量扑杀动物所造成的巨大经济损失。通过感染性克隆来研究标记灭活疫苗和弱毒疫苗,是非常好的技术路线。标记疫苗应该比田间野毒多或者少一种免疫原蛋白或多肽。例如,经过抗原纯化的高效FMD灭活疫苗不含有3ABC抗原,用这种疫苗免疫的动物,不会产生抗3ABC抗体,而FMDV在感染动物体内复制的过程中会产生3ABC抗体,这样,通过检测动物体内的3ABC抗体就可鉴别疫苗免疫与自然感染动物。通过基因工程的方法缺失3A或3B中某一肽段,这样研制的基因缺失标记疫苗,病毒抗原可以不经过严格的纯化过程,可以通过建立检测缺失肽段抗体的方法来区别疫苗免疫动物和自然感染动物。所选择的这种缺失肽段必须具有很好的免疫原性,在自然感染动物体内一定要能够检测到其抗体。通过嵌合表达其他一些病毒的抗原肽段和易于检测的生物分子,也可研制标记疫苗。目前已经建立的口蹄疫病毒的感染性克隆有A12]、O1K1o、OH/99(其基因组序列与O/Tai97非常接近)11以及OH/99的细胞传代毒感染性克隆(方先珍,2004)。有了感染性克隆这个技术平台,就可以开展基因缺失标记疫苗的研究,这其中可包括基因缺失上篇文献综述5弱毒疫苗和基因缺失灭活疫苗。2基因工程活载体疫苗的研究已报道的活病毒载体研究包括痘病毒(oxviru)、腺病毒(adeoviru)、疱疹病毒(hereviru)、腺联病毒(adeo-aociatedviru)、反转录病毒(retroviru)、甲病毒(alhaviru)、脊髓灰质炎病毒(olioviru)和门戈病毒(Megoviru)、登革病毒(Degueviru)、流感病毒(ifluezaviru)、水泡性口膜炎病毒(veiculartomatitivi-u,VSV)。活病毒载体可以分为可复制型和复制缺陷性两类。在口蹄疫活载体疫苗研究中应用的有痘病毒、腺病毒、疱疹病毒载体、甲病毒等。活载体疫苗主要的优点是可以将外源抗原基因有效地导入机体,而不需要动用原始活毒,因而相对安全。所用的病毒载体必须是致弱的(可以复制,但不致病)或者是复制缺陷性的,如果能用疫苗株弱毒研制活病毒载体则具有更高的安全性。对可复制的活载体疫苗来说,在要求疫苗效力好的同时,更应强调其生物安全性,需要在安全性和效力之间寻求平衡。活载体疫苗的另一个优点是可以同时插几种不同的外源抗原基因,生产多价疫苗,一针多防,从而降低疫苗生产的成本。活载体疫苗的最大缺点是宿主会产生强大的针对病毒载体的免疫反应,如果机体已经存在对病毒载体的免疫力,那么初次免疫会受到影响,再次免疫后会邀起机体的强大的排斥反应。这一缺点可以通过采用不同的免疫策略来克服。例如,初次免疫采用载体疫苗,再次免疫可用DNA疫苗或蛋白质亚单位疫苗,或者采用不同的病毒载体疫苗进行免疫。2.1痘病毒载体疫苗痘病毒是大的双股DNA病毒,线型DNA长约130~375k,基因组中含有许多非必需区,至少可以插人25000的外源DNA片段。已经有一种表达人疟原虫7种不同的抗原蛋白的重组痘病毒疫苗进入了临床试验。NYVAC株痘病毒是来自来哥本哈根疫苗株的高度致弱毒,不能够在多数人类细胞系中增殖,在动物体内也表现出高度致弱的特征。ALVAC株是来自金丝雀的疫苗株痘病毒,广泛用作痘病毒载体,只限于在禽类中复制,而不能在哺乳动物体内和细胞中增殖。这两株非复制性痘病毒载体都能用于表达外源基因,刺激机体产生保护性的免疫反应。MVA是另一株非复制型痘病毒载体,是一株安全的疫苗株小痘病毒,是在初代鸡胚成纤维细胞中传代570多代次后形成的,基因组中有多处缺失,在人体内试验的结果没有明显的危险性,机体对这一载体的免疫反应没有复制型病毒强,用其研制的流感、副流感重组疫苗具有很好的效力。另有禽痘病毒、猪痘病毒、山羊痘病毒、浣熊痘病毒活载体的研制和应用。目前应用痘病毒作载体研究的重组活载体疫苗有:人艾滋病、狂犬病、伪狂犬病、禽流感、牛瘟、猪瘟、马立克氏病、新城疫等的重组痘病毒疫苗,均有不同程度的保护作用。利用痘病毒活载体研究口蹄疫病毒载体疫苗的报道并不多,Aram等(I995)即利用痘苗病毒进行了口蹄疫病毒空衣壳的表达2。Saz-Parra等(l998)构建了带有口蹄6动物疫病基因工程疫苗研究与进展疫病毒结构蛋白P1和VP1基因的重组痘苗病毒,免疫豚鼠后可产生抗FMDV的ELISA抗体和细胞免疫反应[1)。Beritei(20OO)构建含FMDVP1基因的重组痘苗病毒,免疫小鼠后可产高滴度的中和抗体,并具很好的免疫保护作用)。然而,口蹄疫病毒重组痘苗病毒载体疫苗在本动物体内的免疫效力试验还未见报道。2.2腺病毒载体疫苗腺病毒是一种无囊膜的双股DNA病毒,基因组大小约为30~40k。腺病毒种类很多。腺病毒感染后的临床症状也比较轻微。人的4和7型腺病毒弱毒疫苗曾被美国军方用于免疫土兵,以预防呼吸道疾病,也常应用腺病毒的弱毒疫苗免疫家养动物来预防一些腺病毒相关疾病。这些实际应用的成功,鼓励了人们开发应用腺病毒载体疫苗的信心。腺病毒载体疫苗有许多优点:首先是重组病毒载体构建相对容易,目前已有许多商品化的腺病毒载体系统;二是重组腺病毒可以达到很高的滴度,可以通过肌肉、鼻腔或口服进行免疫;三是重组腺病毒可以感染很多类型的分裂或静止期细胞,进入细胞的效率很高。通过基因工程的方法可以构建3种类型的重组腺病毒:一种是可复制的重组腺病毒;二是不需要辅助病毒的复制缺陷型的重组腺病毒,需要有特定的包装细胞系;三是需要辅助病毒的复制缺陷型的重组腺病毒。缺失E1/E3区的复制缺陷型的重组腺病毒可以插入约7.5k的外源基因片段;外源基因插入E3和E4缺失区可以产生可复制的重组腺病毒,插入的外源基因可达5~6k。在增殖E1缺失的重组体的时候存在一个问题,是容易通过重组产生一定比例的可复制的腺病毒,现在已经研制出一种包装细胞可以解决这一问题。尽管可复制腺病毒疫苗应用已有许多年了,但已经发现了Ad4弱毒在人群中水平传播的例子。不需要辅助病毒的复制缺陷型重组腺病毒在应用中可能更安全,但复制缺陷型的重组腺病毒的免疫效果却没有可复制的重组腺病毒好,表达伪狂犬病毒(PRV)gD糖蛋白的复制缺陷型重组腺病毒的保护剂量至少是可复制型重组腺病毒的250倍。也有许多利用本种属动物的腺病毒构建可复制重组腺病毒疫苗的研究:如用牛的腺病毒(BAV-3)表达牛疱疹病毒1型(BHV1)gD糖蛋白可以保护小牛不受BHV1的感染;禽腺病毒(FAV-10)-传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2重组体可以保护鸡不受BDV的感染;猪3型腺病毒(PAV-3)和绵羊腺病毒载体疫苗的研究也有报道。口蹄疫腺病毒活载体疫苗的研究比较多,已报道的研究均是以Ad5型腺病毒为载体,一般缺失腺病毒的E1和E3编码区,有些载体也缺失了E4编码区。Saz-Parra等(1999)同样也构建了表达口蹄疫病毒P1编码区的复制缺陷型重组腺病毒,在通过鼻咽部和皮下两种路径免疫试验,证明通过两次免疫牛可产生部分的保护性免疫反应5]。Mayr等(1999;2001)构建了含有FMDVP1-2A-3C基因的A24/A12嵌合型重组腺病毒,同时构建了3C突变型和野生型两株重腺病毒,只有3C野生型重组腺病毒能够将聚蛋白P1裂解为VP0、VP1和VP3及刺激动物产生高水平的中和抗体,说明3C蛋白酶对衣壳的组装是必需的16,1)。这种重组腺病毒一次免疫猪体后7、14和42d用同型病毒攻击,具有很好的保护作用[町。兰州兽医研究所国家口蹄疫参考实验室也构建了表达O型FMDV空衣壳的复制缺陷型重组腺病毒,在豚鼠和猪体内均取得了很好的免疫效果;初步的猪体免疫试验,可使3/4的免疫猪免受强毒攻击感染(未发表资料)。国内外对口蹄···试读结束···...

    2022-10-06 遗传工程 图书推荐 遗传工程 图书分类

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    2022-05-13 基因工程基因表达载体的构建 基因工程 基因重组

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